Istraživači s Instituta Ruđer Bošković (IRB), dr. sc. Damir Đermić, mag. sc. Sven Ljubić i dr. sc. Đurđica Ugarković, u suradnji s dr. Isidorom Feliciellom s Università Federico II iz Napulja, dali su značajan doprinos svjetskoj znanosti. Njihov rad, objavljen u prestižnom znanstvenom časopisu Scientific Reports, postigao je zapaženi uspjeh nalazeći se među "Top 100" najviše preuzetih istraživačkih radova u 2023. godini. Scientific Reports, kao vodeći časopis u objavljivanju istraživanja iz širokog spektra znanstvenih disciplina, u 2023. godini zabilježio je impresivan broj od 22.178 objavljenih radova.

U svom radu, objavljenom u srpnju 2023., ovi znanstvenici predstavili su revolucionarnu metodu analize RNA u stanicama koristeći PCR (lančanu reakciju polimerazom) bez potrebe za prethodnim odvajanjem DNA kontaminanata. Ovo inovativno istraživanje omogućuje točnije određivanje razine RNA, pružajući tako dublji uvid u složene genetske procese i biološke mehanizme. Ova metoda posebno olakšava istraživanje ponavljajućih gena, otvarajući nove mogućnosti u biološkim i genetskim istraživanjima.

U tradicionalnim metodama analize RNA, znanstvenici se suočavaju s izazovom "čitanja" genetskih informacija u uvjetima visoke pozadinske "buke" uzrokovane prisutnošću DNA. Takva kontaminacija DNA može znatno otežati interpretaciju rezultata, slično pokušaju razumijevanja šapata u bučnoj prostoriji. U ovom kontekstu, RNA molekule su te koje prenose vitalne genetske informacije potrebne za sintezu proteina, dok DNA može zamutiti i ometati jasnoću tih informacija.

Kako bi se ova "šaptanja" RNA učinila glasnijim i razumljivijim usred "buke" DNA, znanstvenici se oslanjaju na PCR metodu. Prije započinjanja analize, suočavaju se s izazovom uklanjanja ometajućih DNA molekula. RNA se tijekom procesa amplifikacije pretvara u stabilniju formu, u komplementarnu DNA (cDNA), uz pomoć enzima reverzne transkriptaze. No, razlikovanje cDNA od kontaminirajuće DNA često je teško, a metode za uklanjanje DNA nisu uvijek potpuno učinkovite, što može dovesti do neispravnih rezultata. Metoda koju su predstavili IRB znanstvenici, "Reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) without the need for prior removal of DNA", značajno unaprjeđuje ovaj proces, nudeći novi pristup u molekularnoj biologiji.

Ovom inovacijom, znanstvena zajednica dobiva pristup metodi koja znatno pojednostavljuje analizu RNA, eliminirajući potrebu za prethodnim uklanjanjem DNA kontaminacije. Tehnika se oslanja na upotrebu posebno osmišljenih genetskih "primera" koji se savršeno usklađuju isključivo s cDNA, što omogućuje direktno ciljanje RNA poruka. Ovime se izbjegavaju kompleksni koraci pročišćavanja koji su inače potrebni.

"U odnosu na tradicionalne pristupe, ova metoda pruža veću preciznost, jednostavnost i ponovljivost, čuvajući pritom integritet RNA molekula. Osim toga, izostanak potrebe za upotrebom kemikalija namijenjenih eliminaciji DNA znači da je postupak čišći, dok se smanjuje i potreba za korištenjem uzoraka u svrhu negativnih kontrola," ističe dr. sc. Đurđica Ugarković, koja je doprinosila radu kao dopisna autorica.

Ključna inovacija ove metode leži u upotrebi modificirane klice tijekom faze reverzne transkripcije. Klica, koja je djelomično komplementarna ciljanoj sekvenci RNA, omogućava stvaranje cDNA molekula različitih od genomske DNA. "Zahvaljujući specifičnoj konfiguraciji, ova modificirana klica hibridizira pri temperaturama korištenima u reverznoj transkripciji, između 37 i 42 °C. Pri temperaturi od oko 60 °C, tijekom PCR amplifikacije, ova klica usmjerava detekciju isključivo na specifičnu cDNA, a ne na genomsku DNA," dodaje dr. Ugarković.

Dr. Damir Đermić, kao prvi autor rada, naglašava da je metoda osobito korisna za kvantifikaciju transkripata koji se često ponavljaju u genomu, poput satelitske DNA, kao i za mjerenje ekspresije bakterijskih i virusnih gena.

Posebno važan aspekt metode je njena otpornost na kontaminaciju DNA, koja obično uzrokuje lažno pozitivne rezultate. Osim toga, izbjegavanje koraka uklanjanja DNA pomaže u očuvanju RNA od razgradnje, čime se eliminiraju dva glavna izvora mogućih pogrešaka u analizi transkriptoma.

Financijska potpora ovom istraživanju dolazi kroz projekte Hrvatske zaklade za znanost HRZZ-a, pod brojem IP-2019-04-6915 (voditeljica dr. sc. Đurđica Ugarković) i IP-2019-04-3790 (voditelj dr. sc. Damir Đermić), te kroz sredstva talijanskog Ministarstva obrazovanja, sveučilišta i istraživanja (MIUR), uključujući FFABR2017 i fond FIRB. Također, podrška je pružena i kroz Program mobilnosti međunarodnog osoblja Sveučilišta u Napulju Federico II, koji je dodijelio sredstva dr. sc. Isidori Feliciellu.